Los estímulos mecánicos activan la expresión genética a través de una vía de detección de estrés en la envoltura celular

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13979 (2023) Citar este artículo

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Los mecanismos mecanosensibles se utilizan a menudo para detectar daños en la estructura del tejido, estimulando la síntesis y reparación de la matriz. Si bien este tipo de proceso mecanoregulador es bien reconocido en los sistemas eucariotas, no se sabe si ocurre en las bacterias. En Vibrio cholerae, el daño inducido por antibióticos a la pared celular que soporta carga promueve una mayor señalización por parte del sistema de dos componentes VxrAB, que estimula la síntesis de la pared celular. Aquí mostramos que los cambios en el estrés mecánico dentro de la envoltura celular son suficientes para estimular la señalización de VxrAB en ausencia de antibióticos. Aplicamos fuerzas mecánicas a bacterias individuales utilizando tres modalidades de carga distintas: carga por extrusión dentro de un dispositivo de microfluidos, compresión directa y presión hidrostática. En todos los casos, la señalización de VxrAB, como lo indica una proteína fluorescente, aumentó en las células sometidas a mayores magnitudes de carga mecánica, por lo que diversas formas de estímulos mecánicos activan la señalización de VxrAB. La reducción de la rigidez de la envoltura celular después de la eliminación de la endopeptidasa ShyA provocó grandes aumentos en la deformación de la envoltura celular y un aumento sustancial de la respuesta de VxrAB, lo que respalda aún más la capacidad de respuesta de VxrAB. Nuestros hallazgos demuestran un sistema regulador de genes mecanosensible en bacterias y sugieren que las señales mecánicas pueden contribuir a la regulación de la homeostasis de la pared celular.

Desde hace tiempo se reconoce que las fuerzas mecánicas contribuyen de manera clave al crecimiento y función de los organismos. En los sistemas de los mamíferos, las fuerzas mecánicas regulan una amplia variedad de procesos, incluida la diferenciación celular durante el desarrollo1,2, el inicio y la progresión de la enfermedad3 y la homeostasis de los tejidos4. En tejidos y órganos con funciones de carga, las fuerzas mecánicas a menudo actúan como la señal principal que inicia la remodelación y reparación del tejido, lo que permite que el tejido se adapte a los desafíos mecánicos del entorno y vuelva rápidamente a soportar carga. De este modo, la remodelación del tejido mantiene la homeostasis de la función mecánica al equilibrar la eliminación del tejido dañado con la síntesis de tejido. Las estructuras que soportan carga, incluidos los huesos5, los vasos sanguíneos6 y el citoesqueleto de las plantas7,8, utilizan mecanismos mecanosensibles para mantener la función mecánica.

La mayoría de los estudios de mecanobiología se centran en sistemas eucariotas9, aunque evidencia reciente ha resaltado la importancia de las fuerzas mecánicas en procariotas. En las bacterias, los apéndices extracelulares, incluidos los flagelos y los pili tipo IV, se extienden desde el cuerpo celular para detectar y responder a señales mecánicas del entorno. El montaje y desmontaje de la unidad motora flagelar responde a aumentos y disminuciones de la carga mecánica externa10,11. La inhibición física de la rotación flagelar por contacto con una superficie genera fuerzas de reacción dentro del motor molecular, que estimulan la adhesión a la superficie y la formación de biopelículas12,13. Los pili tipo IV son fibras motorizadas que se extienden y retraen para interactuar con el entorno. Además, la mecanodetección por pili de tipo IV promueve la formación de biopelículas14 y la liberación de factores de virulencia15, y guía la motilidad después de las colisiones16.

La envoltura celular es el principal componente de carga de las bacterias y también es sensible a las fuerzas mecánicas. Los canales iónicos activados por estiramiento dentro de la membrana celular responden rápidamente a los cambios en la osmolaridad abriéndose debido al estiramiento de la membrana, lo que lleva a una mayor supervivencia después del shock hipoosmótico17. El estrés mecánico y la tensión dentro de la envoltura celular también afectan el ensamblaje de complejos de eflujo transenvoltura; por ejemplo, el ensamblaje y la función de la bomba de eflujo multicomponente transenvoltura CusCBA se ven afectados por aumentos en la tensión de corte octaédrica dentro de la envoltura celular18. El estrés mecánico dentro de la envoltura celular también afecta los lugares de inserción de la nueva pared celular en bacterias sometidas a flexión, con mayores cantidades de pared celular insertadas en regiones de mayor tensión de tracción19,20. Aunque estos mecanismos mecanosensibles dentro de la envoltura celular son bien reconocidos, ninguno de los mecanismos identificados hasta la fecha ha demostrado regular la expresión génica relacionada con la remodelación de la pared celular, un componente esencial de la envoltura celular. Se ha planteado la hipótesis de que los sistemas reguladores de genes actualmente asociados con otras formas de estrés celular también pueden ser mecanosensibles21 y un informe reciente sugiere que el confinamiento mejora la señalización de Rcs y la posterior resistencia a los bacteriófagos en E. coli22. Si en la remodelación y homeostasis de la envoltura celular intervienen mecanismos mecanosensibles, se esperaría que el estrés y la tensión mecánicos regularan la síntesis de los componentes de la envoltura celular.

Vibrio cholerae, el agente causante de la enfermedad del cólera, sobrevive a cambios rápidos de osmolaridad durante la transición entre agua dulce y salobre, ambientes marinos y los intestinos de un huésped. Los cambios de osmolaridad dan lugar a fluctuaciones en la turgencia que alteran la tensión mecánica en la envoltura celular. Las estructuras primarias que contrarrestan la turgencia son la pared celular de peptidoglicano (PG) y la membrana externa (MO)23. Por lo tanto, para mantener propiedades mecánicas adecuadas, las bacterias deben mantener la integridad mecánica tanto del PG como del OM, y este parece ser el caso del OM23,24. No se comprende bien si la fuerza del PG se controla homeostáticamente y cómo.

En Vibrio cholerae, el sistema de dos componentes VxrAB es el principal sistema de respuesta al estrés de la pared celular25,26,27. VxrAB se induce mediante la exposición a antibióticos que actúan sobre la pared celular y la sobreexpresión de enzimas líticas de la pared celular dentro del periplasma como la endopeptidasa ShyA27,28. Tras la inducción, VxrAB regula positivamente su propia expresión, así como las funciones de síntesis de la pared celular, incluida la translocasa PG MurJ, las principales PG sintasas (proteínas de unión a penicilina, PBP) y los genes de síntesis de precursores de PG (Fig. 1A)27. En consecuencia, la activación de VxrAB da como resultado un mayor contenido de la pared celular y una mayor resistencia al choque osmótico27. Estos mecanismos son consistentes con la idea de que VxrAB contribuye a la homeostasis de la pared celular, similar a WalKR en la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis29. De acuerdo con esta idea, un mutante ∆vxrAB exhibe un mayor ancho celular durante el crecimiento normal27, un hallazgo esperado si la rigidez de la pared celular estuviera afectada pero la presión de turgencia permaneciera igual. Es importante destacar que VxrAB también es esencial para la supervivencia después de la exposición a antibióticos que actúan en la pared celular, como los betalactámicos27,28. La exposición a betalactámicos induce alteraciones a gran escala de las propiedades mecánicas de la envoltura celular, incluido un cambio de una célula rígida en forma de bastón contenida por una pared celular a un esferoplasto membranoso30,31. La recuperación del estado de esferoplasto depende principalmente de VxrAB28, presumiblemente porque la regeneración de la forma de bastón requiere una mayor síntesis de la pared celular. Por tanto, el sistema VxrAB modula las propiedades mecánicas de la célula en respuesta a desequilibrios en el recambio de PG. Sin embargo, aún se desconoce la señal que produce la inducción de VxrAB.

La señalización VxrAB responde a la tensión mecánica de la carga de extrusión. (A) Cuando se activa, la histidina quinasa de membrana interna VxrA fosforila el regulador de respuesta VxrB, que regula la expresión genética de regulones que incluyen murJ y vxrAB. Las fusiones transcripcionales de msfGFP para murJ y vxrAB se utilizaron como indicadores para la señalización de VxrAB. La función ShyA promueve la señalización de VxrA a través de un mecanismo desconocido. (B) La carga por extrusión implica forzar a las bacterias bajo presión de fluido a entrar en canales cónicos. (arriba) Las células se deforman más y experimentan una mayor carga mecánica a una mayor diferencia de presión en los canales cónicos. (abajo) ΔcrvA PmurJ:msfGFP Se muestra Vibrio cholerae que expresa GFP mientras está atrapado dentro de canales cónicos (se muestra un "conjunto" de canales cónicos con la misma presión diferencial). (C) Los Vibrio cholerae tienen forma de media luna. (D) Los Vibrio cholerae con deleción de crvA tienen forma de bastón. (E) Fluorescencia unicelular de PmurJ: células msfGFP frente a diferencia de presión. La línea continua es una regresión lineal. (F) Fluorescencia de una sola célula de ΔcrvA PmurJ: células msfGFP (rosa) y (G) ΔcrvA ΔvxrB box PmurJ: células msfGFP (azul) frente a diferencia de presión. Las líneas continuas son regresiones lineales. La pendiente de la celda ΔcrvA PmurJ:msfGFP (rosa) es mayor que la pendiente de la caja ΔcrvA ΔvxrB PmurJ:células msfGFP (azul) (p <0,001). (H) El mutante vxrA H301A con histidina quinasa modificada. (I) Fluorescencia de células individuales de células ΔcrvA PvxrAB:msfGFP frente a diferencia de presión. La línea continua es una regresión lineal.

Aquí estudiamos la expresión génica controlada por VxrAB durante la estimulación mecánica de la envoltura celular de Vibrio cholerae. Aplicamos tensión mecánica y tensión a la envoltura de la célula bacteriana utilizando dos modalidades de carga distintas: carga por extrusión dentro de un dispositivo de microfluidos, compresión de células completas y presión hidrostática. En cada una de estas situaciones encontramos que las bacterias que experimentan mayores magnitudes de carga mecánica exhiben una mayor activación del regulón VxrAB. Nuestros hallazgos respaldan la idea de que el estrés mecánico y la tensión desempeñan un papel en la regulación de la síntesis y la homeostasis de la envoltura celular y demuestran la existencia de sistemas reguladores de genes que pueden ser inducidos por el estrés mecánico en la envoltura celular.

Para investigar el papel del estrés mecánico en la señalización de VxrAB, utilizamos un dispositivo de microfluidos personalizado para aplicar cargas mecánicas controladas y reproducibles en un proceso que llamamos "carga de extrusión". La carga por extrusión utiliza la presión del fluido para empujar las bacterias hacia canales estrechos y cónicos con dimensiones submicrónicas (Fig. 1B)18,32. Las células quedan alojadas en los canales cónicos y experimentan fuerzas mecánicas a medida que las paredes del canal las deforman. La diferencia de presión (∆P) a través del canal cónico regula la magnitud de la tensión mecánica experimentada por una celda atrapada. Las células sometidas a una mayor diferencia de presión dentro de los canales cónicos viajan más hacia los canales cónicos y experimentan una mayor deformación por las paredes del canal y mayores magnitudes de tensión mecánica. Los modelos analíticos y de elementos finitos indican que la carga de extrusión produce aumentos en la tensión de tracción axial (a lo largo de una celda en forma de varilla), reducciones en la tensión de tracción circular (circunferencialmente alrededor de la envoltura de la celda) y aumentos en el corte octaédrico (cambio de forma). ) estrés en la envoltura celular18.

Utilizamos una fusión transcripcional de PmurJ:msfGFP como un informador bien establecido para la señalización de VxrAB (Fig. 1A). MurJ codifica la flippasa del lípido II para el precursor de peptidoglicano, y voltear el precursor de peptidoglicano hacia el espacio periplásmico es fundamental para el ensamblaje de la pared celular33. El regulador de respuesta VxrB tiene una alta afinidad por la unión directa del promotor murJ28 y, en consecuencia, la expresión de murJ está fuertemente controlada por VxrAB27, lo que hace que esta construcción sea una lectura sólida de la activación de VxrAB. Aplicamos carga de extrusión a células PmurJ:msfGFP durante dos horas para permitir tiempo suficiente para la transcripción y el plegamiento de proteínas, luego medimos la fluorescencia de células individuales para cuantificar la expresión de msfGFP bajo el control del promotor MurJ. La fluorescencia de las células PmurJ:msfGFP aumentó al aumentar la magnitud de la carga de extrusión (Fig. 1E), lo que respalda la idea de que la señalización de VxrAB es mecanosensible (aunque es posible que la fluorescencia se sature después de una presión diferencial de 3 kPa).

Las células de Vibrio cholerae exhiben naturalmente una forma de media luna (Fig. 1C). El enderezamiento de una celda en forma de media luna dentro del dispositivo de microfluidos durante la carga de extrusión da como resultado tensiones mecánicas adicionales que incluyen mayores tensiones de tracción en el lado cóncavo de la celda y tensiones de compresión en el lado convexo. Para determinar si la respuesta fluorescente mecanosensible se debió únicamente al estrés causado por el enderezamiento de las células, creamos V. cholerae en forma de varilla eliminando crvA (Fig. 1D) 34 y sometimos células ΔcrvA PmurJ:msfGFP a carga de extrusión. CrvA es una proteína polimérica periplásmica responsable de la curvatura en V. cholerae; la eliminación de crvA da como resultado células en forma de bastón34. La fluorescencia de las células ΔcrvA PmurJ:msfGFP también aumentó al aumentar la diferencia de presión (Fig. 1F, magenta), lo que sugiere que la curvatura celular no es necesaria para la respuesta fluorescente mecanosensible de las células PmurJ:msfGFP durante la carga de extrusión. La diferencia en la pendiente de la fluorescencia frente a la diferencia de presión entre las células en forma de media luna y las en forma de varilla puede explicarse por las tensiones adicionales que experimentan las células en forma de media luna al enderezarse. Todos los experimentos posteriores se realizaron con células ΔcrvA en forma de varilla. La señal de autofluorescencia de las células ΔcrvA que no producen GFP no aumentó con mayores magnitudes de carga de extrusión (Figura complementaria S1) ni la fluorescencia informadora se relacionó con la magnitud del estrés mecánico en los primeros minutos después del inicio de la carga de extrusión (Figura complementaria). S2).

Para confirmar que la respuesta mecanosensible se debió a la expresión de PmurJ:msfGFP activada por VxrB, utilizamos un mutante con una eliminación parcial del sitio de unión de VxrB en el promotor MurJ (ΔcrvA PmurJΔvxrB box:msfGFP); Anteriormente establecimos que este mutante carece de capacidad de respuesta a VxrAB28. Bajo carga de extrusión, la fluorescencia de dichas células mutantes mostró solo correlaciones pequeñas y negativas con la magnitud de la presión (Fig. 1G, azul). Las células deficientes en vxrAB no muestran una respuesta mecanosensible (Figura complementaria S3). De manera similar, una mutación en el residuo de histidina fosforilada conservada en VxrA en su locus cromosómico nativo (cepa H301A) que da como resultado una fenocopia de una cepa ∆vxrAB (Figura complementaria S4) conduce a una mala relación entre la carga mecánica y la señalización de PmurJ (Figura .1H, p = 0,05). En conjunto, estos datos demuestran que la activación de VxrB a través de la función histidina quinasa canónica es necesaria para el aumento mecanosensible en la expresión de PmurJ:msfGFP.

Además de su papel en la inducción de MurJ, la señalización de VxrAB también está autorregulada (Fig. 1A)28. Para confirmar que la respuesta mecanosensible de VxrAB no se limitaba al promotor MurJ, también utilizamos una cepa indicadora PvxrAB:msfGFP como lectura alternativa de la activación de VxrAB. La fluorescencia celular de las células PvxrAB:msfGFP aumentó con una mayor diferencia de presión (Fig. 1I), lo que confirma que el estrés mecánico en la envoltura celular regula la señalización de VxrAB (tenga en cuenta que la actividad basal del promotor VxrAB difiere de la del promotor MurJ, lo que da como resultado diferentes cantidades totales de fluorescencia celular). Concluimos que la activación de VxrAB es sensible a la tensión mecánica de la carga de extrusión.

Para confirmar que la respuesta mecanosensible de la señalización de VxrAB no es específica del entorno del dispositivo de microfluidos o de las formas de tensiones mecánicas generadas por la carga de extrusión, investigamos la respuesta de la señalización de VxrAB a otros métodos de carga mecánica.

Para aplicar compresión, las células se intercalaron entre gel de agarosa y un portaobjetos de vidrio pesado (Fig. 2A). A mayores magnitudes de fuerza aplicada, las células experimentaron una mayor carga mecánica y se deformaron a un mayor ancho de celda en el plano de imagen (Figura complementaria S5). La compresión provoca aumentos en la tensión de tracción en las direcciones axial y circular y un aumento general en la tensión de corte octaédrico (que cambia de forma) dentro de la envoltura celular. Las células PmurJ:msfGFP se sometieron a una carga de compresión durante dos horas (la misma duración que experimentaron las células bajo carga de extrusión) y luego se midió la fluorescencia de las células individuales para cuantificar la expresión de PmurJ:msfGFP. Aunque hubo una mayor variabilidad en la fluorescencia celular, en promedio la fluorescencia celular aumentó un 30% al aumentar la magnitud de la fuerza de compresión aplicada (Fig. 2B, izquierda), lo que indica que la señalización de VxrAB es sensible a la carga de compresión. Por el contrario, al eliminar la caja vxrB en el promotor (caja ΔvxrB), la relación entre la fluorescencia celular y la fuerza de compresión aplicada no fue detectable (Fig. 2B, derecha), lo que sugiere que el aumento mecanosensible en la fluorescencia celular para las células PmurJ:msfGFP bajo la compresión también requirió la activación de VxrB. Nuevamente utilizamos células PvxrAB: msfGFP como informador secundario para la señalización de VxrAB. La fluorescencia celular de las células PvxrAB:msfGFP aumentó al aumentar la fuerza de compresión aplicada (Fig. 2C), lo que respalda aún más la idea de que la respuesta mecanosensible a la compresión está mediada por VxrAB. Observamos que la fluorescencia de msfGFP muestra una variación mayor entre las células individuales durante la carga de compresión que durante la carga de extrusión, lo que probablemente se debe a que esta modalidad de carga no controla rigurosamente la orientación de las células en relación con la carga, la cantidad de carga aplicada a cada individuo o célula-célula. contacto, todo lo cual puede alterar el estado de tensión mecánica dentro de la envoltura celular.

La señalización VxrAB responde al estrés mecánico por compresión y presión hidrostática. (A) Durante la compresión, las células se intercalan entre gel de agarosa y un portaobjetos de vidrio pesado. (B) Fluorescencia de células individuales de células ΔcrvA PmurJ:msfGFP (rosa, n = 1130, 1160, 1304 en orden de carga), células ΔcrvA ΔvxrB box PmurJ:msfGFP (azul, n = 1461, 1189, 1304) y (C ) Células ΔcrvA PvxrAB:msfGFP (verde, n = 1541, 1058, 1826) frente a fuerza de compresión aplicada. Las líneas continuas son regresiones lineales. La pendiente de las células ΔcrvA PmurJ:msfGFP (rosa) es mayor que la pendiente de la caja ΔcrvA ΔvxrB PmurJ:células msfGFP (azul) (p <0,001). (D) La presión hidrostática aplica fuerza por igual a todas las superficies de la celda comprimiendo la envoltura celular. (E) Fluorescencia de una sola célula de ΔcrvA PmurJ: células msfGFP (rosa, n = 3845, 2261, 1393), ΔcrvA ΔvxrB box PmurJ: células msfGFP (azul, n = 2085, 1194, 1554). La pendiente de las células ΔcrvA PmurJ:msfGFP (rosa) es mayor que la pendiente de la caja ΔcrvA ΔvxrB PmurJ:células msfGFP (azul) (p <0,001). (F) Células ΔcrvA PvxrAB:msfGFP (verde, n = 2332, 1971, 907) frente a presión hidrostática. Las líneas continuas son regresiones lineales.

Para complementar estos hallazgos, evaluamos el papel de la presión hidrostática en la inducción de VxrAB. La presión hidrostática ejerce una fuerza perpendicular a todas las superficies de la envoltura celular (Fig. 2D-F). La presión hidrostática extrema (> 50 MPa) provoca cambios en la síntesis de ARN y la replicación del ADN y puede provocar la muerte celular35; aquí aplicamos una presión hidrostática suave de 0 a 100 kPa (una bacteria a 10 m bajo el agua experimenta aproximadamente 100 kPa de presión hidrostática); en contraste, se espera que una célula que sale de un sistema gastrointestinal huésped y entra en agua salobre experimente un aumento en la presión de turgencia de 500 kPa. . La presión hidrostática aumenta las tensiones de compresión perpendiculares a la envoltura celular. La magnitud de las tensiones mecánicas causadas por la presión hidrostática suele ser mucho menor que las tensiones circulares y longitudinales (orientadas paralelas a la superficie de la envoltura de la celda) generadas por la carga de extrusión o la compresión, pero en condiciones de presión hidrostática aplicada pueden volverse perceptibles. Se aplicó presión hidrostática a las células suspendidas en medios líquidos en una cámara personalizada conectada a una bomba de microfluidos. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, las células se retiraron y visualizaron. La fluorescencia celular promedio aumentó un 28% al aumentar la magnitud de la fuerza de compresión aplicada (Fig. 2E, izquierda), lo que respalda la idea de que la señalización de VxrAB también es sensible a la presión hidrostática. Al eliminar la caja vxrB en el promotor, la fluorescencia celular no varió con la presión hidrostática aplicada (Fig. 2E, derecha), lo que confirma que el aumento mecanosensible en la fluorescencia celular para las células PmurJ:msfGFP requirió la activación de VxrB. Al igual que en los experimentos de compresión, la cepa indicadora de PvxrAB:msfGFP fue consistente con las observaciones con PmurJ:msfGFP (Fig. 2F). La variación en la fluorescencia fue mayor que la observada en la carga de compresión, un hallazgo que atribuimos al hecho de que las tensiones mecánicas en la envoltura celular se limitan a la compresión radial y no están tan bien controladas (el contacto de las células con las paredes del dispositivo y otras células está completamente descontrolado). Como resultado, la respuesta mecanosensible a la presión hidrostática estuvo dominada por un subconjunto de células (parte superior de la población celular en la Fig. 2E, F). Concluimos que la señalización VxrAB responde a diversos métodos de aplicación de carga mecánica a la envoltura celular.

Se sabe que VxrAB responde al daño de la pared celular causado por antibióticos dirigidos a la pared celular y a la actividad de la endopeptidasa ShyA a través de un mecanismo desconocido (Fig. 1A)27. La endopeptidasa ShyA desempeña un papel clave en la homeostasis de la pared celular y el alargamiento celular a través de la degradación controlada de la pared celular en V. cholerae36. Por lo tanto, la eliminación de ShyA puede modular la rigidez de la envoltura celular, lo que puede afectar a VxrAB y la respuesta mecanosensorial asociada. Para explorar la posibilidad de que la señalización mecanosensible de VxrAB dependa de señales ascendentes de ShyA, expusimos mutantes en los que se eliminó shyA a la carga de extrusión y medimos los cambios resultantes en la señalización de VxrAB.

De hecho, las células ΔshyA PmurJ:msfGFP exhibieron una fisiología notablemente perturbada con ampollas, curvas y forma anormal, lo que sugiere la posibilidad de propiedades mecánicas de la envoltura celular deterioradas que podrían reducir la rigidez celular (Fig. 3A). Las células con shyA eliminado eran más anchas que las células con expresión normal de shyA fuera del dispositivo de microfluidos (Fig. 3B, arriba versus abajo), una observación esperada si se redujera la rigidez de la envoltura celular. Especulamos que la eliminación de ShyA puede conducir a reducciones en la rigidez de la envoltura celular, por ejemplo, al provocar la sobreexpresión de otras enzimas líticas de la pared celular. Las células deficientes en ShyA no viajaron tan lejos en los canales cónicos durante la carga de extrusión como las células con expresión normal de ShyA (Fig. 3C), lo que sugiere potencialmente que las células defectuosas en la actividad principal de la endopeptidasa experimentaron una deformación celular insuficiente en comparación con las células con expresión normal de ShyA. Sin embargo, debido a que inicialmente son más anchas, las células ΔshyA PmurJ:msfGFP en realidad experimentan una mayor tensión/deformación mecánica que las células PmurJ:msfGFP a pesar de no viajar tan lejos en el canal cónico. De hecho, al comparar el ancho de las células dentro y fuera de los canales cónicos, las células ΔshyA PmurJ:msfGFP experimentaron una mayor disminución porcentual (promedio de disminución del 40 %, 0,91 ± 0,11 μm sin deformar frente a 0,54 ± 0,09 μm cargadas, media ± SD) en el ancho de las células. en comparación con las células PmurJ:msfGFP (promedio de disminución del 25% en el ancho de la celda, 0,67 ± 0,06 μm sin deformar frente a 0,51 ± 0,03 μm cargadas). Se esperaría que deformaciones mayores dentro de los canales cónicos mejoraran la respuesta de los mecanismos sensibles a la tensión mecánica dentro de la envoltura celular.

Mecanosensibilidad a ShyA y VxrAB. (A) Una imagen de la morfología celular ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP cultivada en medio M9 en una placa de Petri. Las células muestran una morfología anormal. (B) Arriba: ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP ancho de célula en una placa de Petri. Abajo: ΔcrvA PmurJ:msfGFP ancho de celda en una placa de Petri. (C) La distancia recorrida en el canal cónico para las células ΔshyA ΔcrvA PmurJ:msfGFP (negro) es menor que en las células ΔcrvA PmurJ:msfGFP (rosa) a magnitudes de presión similares. (D) Fluorescencia de una sola célula de células ΔshyA ΔcrvA PvxrAB:msfGFP frente a la diferencia de presión en la carga de extrusión (negro). (E) La fluorescencia de una sola célula de las células ΔshyA ΔcrvA ShyA + + PmurJ:msfGFP frente a la diferencia de presión muestra una pendiente (2216 ± 613, estimación ± SE) más cercana a la de la Fig. 1F (4690 ± 486). La línea verde sólida es una regresión lineal.

De acuerdo con esta posibilidad, la fluorescencia inicial de las células con shyA eliminado (ΔshyA PmurJ:msfGFP, 8.84e + 04 en promedio, Fig. 3D) bajo carga de extrusión fue mayor que la de las células con shyA intacto (4.04e + 04 en promedio, Figura 1F). Sin embargo, la respuesta estuvo poco correlacionada con la magnitud de la carga de extrusión (una ligera relación negativa en lugar de positiva, Fig. 3D). Cuando se reintrodujo ShyA en trans (ΔshyA ShyA + + PmurJ:msfGFP), la respuesta mecanosensible se restableció parcialmente: la fluorescencia celular aumentó al aumentar la diferencia de presión con una pendiente más cercana a la observada en ΔcrvA PmurJ:msfGFP (Fig. 3E, en comparación con línea rosa en la Fig. 1F). Dado que las células en canales cónicos para ambos grupos experimentan la misma diferencia de presión, la mala correlación entre la fluorescencia y la diferencia de presión en las células ΔshyA PmurJ:msfGFP no se debe a diferencias en la fuerza mecánica aplicada. En cambio, interpretamos que este hallazgo es una inducción muy alta, quizás saturante, de la señalización de VxrAB bajo las mayores magnitudes de deformación experimentadas por las células ΔshyA. Una posibilidad adicional es que la ausencia de ShyA produzca cambios en la estructura de PG de una manera que la haga no propicia para la mecanodetección mediada por VxrAB. Aunque los mecanismos de mecanotransducción que hacen que VxrAB sea mecanosensible aún no están claros, estos hallazgos demuestran cómo la rigidez de la envoltura celular puede regular la respuesta de la señalización de VxrAB a la carga mecánica.

Hemos demostrado que el sistema de señalización de dos componentes VxrAB se activa mediante estrés mecánico en la envoltura celular causado por distintas modalidades de carga mecánica. Estos hallazgos indican que los mecanismos mecanosensibles dentro de la envoltura celular pueden regular la expresión genética implicada en la remodelación de la pared celular.

Nuestros hallazgos con respecto a la mecanosensibilidad de VxrAB son consistentes con la idea de que el estrés y la tensión mecánicos pueden contribuir a la homeostasis de la pared celular. La capacidad del estrés mecánico y la tensión para contribuir a la remodelación de un componente que soporta carga, como la pared celular, es un medio poderoso para mantener la función de la envoltura celular. Si bien desconocemos otros estudios que investiguen directamente los efectos del estrés mecánico sobre el mantenimiento de la pared celular en otras bacterias, existen otros sistemas de dos componentes que regulan la remodelación de la pared celular. El sistema de dos componentes WalKR en Bacillus subtilis responde a la degradación de los constituyentes de la pared celular para regular la remodelación de la pared celular29. Además, hallazgos recientes indican que la membrana externa también es capaz de soportar cargas mecánicas23, lo que abre la posibilidad de que la síntesis y el transporte de los componentes de la membrana externa puedan ser sensibles al estrés mecánico.

Una limitación de este estudio es la variación en la respuesta de fluorescencia entre las células en cada magnitud de carga aplicada. La magnitud de la variación sigue el mismo patrón que el grado de control de la carga mecánica de cada celda (mayor control en el sistema de microfluidos, menos en la carga de compresión, incluso menos en la presión hidrostática), lo que sugiere que la variación en las tensiones mecánicas experimentadas por las células individuales es la causa primaria. Incluso con el sistema de carga más controlado, es probable que queden variaciones de una célula a otra que pueden ser causadas por la fisiología celular o la variación natural en la rigidez de la envoltura celular dentro de la población. Se necesitarían más estudios para comprender las fuentes de esta variación con más detalle. A pesar de esta limitación, la gran cantidad de celdas examinadas permite detectar tendencias significativas que relacionan la carga mecánica aplicada con la señalización VxrAB.

La naturaleza mecanosensible de VxrAB sugiere posibles aplicaciones en el campo de la biología sintética. Los mecanismos reguladores de genes que responden al entorno externo son herramientas clave en el campo de la biología sintética. Para controlar los circuitos de genes sintéticos se han utilizado sistemas que responden a sustancias químicas específicas, a la luz, a la temperatura y al pH37. Nuestro trabajo demuestra que los sistemas de dos componentes pueden responder al estrés mecánico en la envoltura celular, proporcionando un mecanismo mecánico adicional para estimular circuitos genéticos para aplicaciones de biología sintética.

Los métodos para la fabricación de dispositivos microfluídicos utilizados aquí son similares a los que se describen en nuestros trabajos publicados anteriormente18,32, excepto que la profundidad del grabado se redujo para adaptarse a las dimensiones celulares más pequeñas de Vibrio cholerae en comparación con E. coli examinada en trabajos anteriores. Se modelaron obleas de sílice fundida (100 mm de diámetro y 500 µm de espesor, WF3937X02031190, Mark Optics, Santa Ana, CA, EE. UU.) utilizando fotolitografía UV profunda en las instalaciones de sala blanca de Cornell NanoScale Facility Science and Technology Facility (Ithaca, NY, EE. UU.). Primero se recubrieron obleas de sílice fundida limpias con ~ 55 nm de cromo utilizando la herramienta de deposición por pulverización AJA (AJA International, Scituate MA, EE. UU.). Luego se utilizó la herramienta de desarrollo de recubrimiento automático Gamma (Suss MicroTec Gamma Cluster Tool, Garching Alemania) para aplicar una capa de ~ 60 nm de recubrimiento antirreflectante (ARC, DUV 42P, Brewer Science, Rolla, MO, EE. UU.) y ~ 510 nm capa de fotoprotector (UV210, MicroChem, Westborough, MA, EE. UU.). El fotorresistente se expuso a nuestro patrón de dispositivo de microfluidos personalizado utilizando el paso a paso ASML Deep UV (Veldhoven, Países Bajos), luego el fotorresistente se reveló inmediatamente utilizando la herramienta de revelado automático de capas Gamma. El patrón se transfirió del fotorresistente al revestimiento antirreflectante mediante grabado con plasma en la herramienta Oxford 82 (Oxford, Abingdon, Reino Unido), luego se transfirió a la capa de cromo con grabado con plasma utilizando la herramienta ICP Plasma-Therm 770 (Plasma-Therm San Petersburgo FL, EE.UU.). Cualquier recubrimiento antirreflectante restante se eliminó con una limpieza con oxígeno por plasma en la herramienta Oxford 82. Finalmente, el patrón se transfirió a la sílice fundida con grabado con plasma utilizando la herramienta Oxford 100 (Oxford, Abingdon, Reino Unido). El cromo restante se eliminó mediante un baño químico húmedo. Se grabaron con láser orificios pasantes en las entradas y salidas del dispositivo de microfluidos utilizando un Versalaser (VLS3.50, Universal Laser Systems, Scottsdale, AZ, EE. UU.).

Las dimensiones de las características de la oblea se caracterizaron utilizando un perfilómetro, un microscopio de fuerza atómica y un microscopio electrónico de barrido. La profundidad de grabado objetivo para los canales era al menos dos desviaciones estándar mayor que el ancho de la celda (> 0,80 µm), de modo que las células pudieran fluir libremente a través de todos los canales de alimentación y solo quedaran atascadas en la estrecha constricción de los canales cónicos. La profundidad del grabado del canal de alimentación se caracterizó utilizando un perfilómetro (P-7, KLA Inc, Milpitas CA, EE. UU.). La punta del perfilómetro era demasiado ancha para medir los canales cónicos, por lo que se utilizó una punta de microscopía de fuerza atómica de alta relación de aspecto para medir la profundidad del grabado de los canales cónicos (Veeco Icon Bruker, Billerica MA, EE. UU.). La profundidad del grabado del canal fue de 0,88 ± 0,03 µm. Se utilizó un microscopio electrónico de barrido (microscopio Zeiss Ultra 55 SEM, Oberkocken Alemania) para medir el ancho de entrada del canal cónico (1,48 ± 0,07 µm) y el ancho de salida (0,35 ± 0,02 µm). La entrada del canal cónico es lo suficientemente ancha para que las células puedan entrar y la salida es lo suficientemente estrecha para evitar que las células salgan.

Las obleas estampadas se unieron a obleas de cubierta de sílice fundida de 100 mm de diámetro y 170 µm de espesor (WF3937X0073119B Mark Optics, Santa Ana CA, EE. UU.). Se eligió que el espesor de la oblea de cobertura fuera el mismo que el de los cubreobjetos estándar. Tanto las obleas estampadas como las de cubierta se limpiaron con MOS/RCA antes de unirlas. Las obleas se unieron suavemente a mano y luego se sometieron a recocido con nitrógeno durante 5 h a 1100 °C. Se dejó que las obleas reposaran al menos una semana antes de su uso para que madurara la unión.

El diseño del dispositivo de microfluidos se ha descrito previamente en nuestros trabajos publicados18,32. La presión del fluido empuja las células bacterianas hacia canales estrechos y cónicos, un proceso al que nos referimos como carga de extrusión (Figura complementaria S6). La célula experimenta deformación, tensión mecánica y tensión en la envoltura celular al verse constreñida por las paredes del canal. La presión fluida es mayor en la entrada ancha del canal y menor en la salida estrecha del canal, empujando las células hacia la salida. Nos referimos a la diferencia de presión entre la entrada ancha y la salida estrecha del canal cónico como diferencial de presión (ΔP). Las celdas en los conos con un mayor diferencial de presión experimentan una mayor magnitud de carga mecánica, viajan más dentro del canal cónico y se deforman más que las celdas en los conos con un menor diferencial de presión. La distancia que recorre la celda hacia el canal cónico depende de la magnitud del diferencial de presión, el ancho inicial de la celda, la rigidez de la celda y el ancho de la celda antes de la entrada al canal cónico.

Durante cada experimento se observan cientos de células bajo múltiples magnitudes de carga. Se colocan en paralelo doce conjuntos de cinco canales cónicos y se conectan mediante un canal de derivación (Figura complementaria S6). La presión es más alta en la entrada del canal de derivación y más baja en la salida del canal de derivación debido a la pérdida de presión debido a la resistencia hidráulica; por lo tanto, los canales cónicos cerca de la entrada y salida de derivación experimentan el mayor diferencial de presión (ΔP) (Figura complementaria S6). Se colocan diez canales de derivación en paralelo y se conectan mediante canales de alimentación a un único puerto de entrada para el dispositivo de microfluidos (Figura complementaria S6). Mientras están atrapadas en los canales cónicos, las células permanecen vivas durante horas y se las observa alargándose y dividiéndose.

Se utilizó presión de fluido para cargar las células en el dispositivo de microfluidos. La presión se generó utilizando una bomba PneuWave (CorSolutions, Ithaca NY, EE. UU.). Se conectó un tubo PEEK (Idex 360 µm OD × 150 µm ID, Lake Forest IL, EE. UU.) a la bomba PneuWave. Se lavó alcohol isopropanol a través del tubo de PEEK durante 5 minutos para su esterilización, luego se lavó medio mínimo M9 a través del tubo durante 5 minutos para eliminar el alcohol isopropanol y preparar el tubo para las células. Se utilizaron un brazo de palanca de conector magnético (Fluidic Indexing Probe, CorSolutions, Ithaca NY, EE. UU.) y una junta (N-123-03 IDEX, Lake Forest IL, EE. UU.) para formar un sello de compresión que conecta el tubo de PEEK al dispositivo de microfluidos. Se pasó medio mínimo M9 a través del dispositivo de microfluidos para humedecer previamente todos los canales y expulsar las burbujas.

El tubo y el conector se desconectaron del dispositivo de microfluidos y el cultivo celular se lavó a través del tubo a una presión aplicada de 60 kPa durante 5 minutos. Luego se volvió a conectar el tubo al dispositivo de microfluidos y las células fluyeron hacia el dispositivo. La presión aplicada se mantuvo a 60 kPa durante el resto del experimento. Las imágenes comenzaron dos horas después de que todos los niveles de presión en el dispositivo de microfluidos se cargaran con células. El tiempo de dos horas se determinó a partir de experimentos preliminares; la señal fluorescente aumentó desde el inicio del experimento hasta las 2 h, luego permaneció constante de 2 a 6 h.

La presión fluídica en los canales cónicos dentro del dispositivo de microfluidos no se pudo medir directamente, por lo que se calculó utilizando la presión en la entrada del dispositivo (medida con la bomba PneuWave) y un modelo de circuito hidráulico con la ley de Hagen-Poiseuille (Eq. .1). ΔP es la diferencia de presión entre el extremo aguas arriba y el extremo aguas abajo de un canal, Q es el caudal y Rh es la resistencia hidráulica del canal.

La resistencia hidráulica de cada canal lineal en el dispositivo de microfluidos se determinó individualmente utilizando el flujo de Poiseuille (ecuaciones 2 y 3) o el flujo de Poiseuille plano (ecuación 4), donde µ es la viscosidad del fluido (se supone que es la viscosidad del agua = 8,9e). −4 Pa s), L es la longitud del canal, A es el área de la sección transversal del canal, r es el radio hidráulico, P es el perímetro de la sección transversal del canal y H es la altura del canal . El flujo Poiseuille (ecuaciones 2 y 3) se usó para canales donde la relación entre el ancho de la sección transversal del canal y la altura de la sección transversal del canal era menor que 20, y el flujo plano Poiseuille (ecuación 4) se usó para canales donde la relación era mayor que 20.

La resistencia hidráulica de todo el dispositivo de microfluidos se determinó combinando la resistencia hidráulica de todos los canales lineales individuales. Los canales en paralelo se combinaron usando la ecuación. (5) donde RTotal es la resistencia hidráulica combinada de los canales 1 a n.

Los segmentos en serie se combinaron usando la ecuación. (6) donde RTotal es la resistencia hidráulica combinada de los canales 1 a n.

Debido a la compleja geometría de los dispositivos, estos cálculos del circuito hidráulico se realizaron utilizando un script personalizado en MATLAB (v. 2019a, Mathworks, Natick, MA, EE. UU.).

Cuando una celda ocupa un canal cónico, la celda bloquea parcialmente el flujo de fluido y por lo tanto provoca un aumento en la resistencia hidráulica de ese canal. Dado que el perfil de flujo de fluido alrededor de la celda es irregular (el canal cónico tiene una sección transversal trapezoidal y una celda tiene una sección transversal circular), las Ecs. (2) y (3) no eran apropiados. Para determinar la resistencia hidráulica de un canal cónico ocupado por una celda, creamos un modelo utilizando COMSOL Multiphysics (v 4.3, Estocolmo, Suecia). La resistencia hidráulica de un canal cónico ocupado por una celda es un orden de magnitud mayor que la de un canal cónico sin celda. De acuerdo con las observaciones experimentales, se supuso que todos los canales cónicos estaban ocupados por una celda.

Las dimensiones de las células y la fluorescencia de las células se determinaron utilizando un script personalizado en MATLAB (v. 2019a, Mathworks, Natick, MA, EE. UU.). Las dimensiones de las celdas de cada celda en los dispositivos de microfluidos se determinaron a partir de la imagen de transmisión óptica. Las propiedades ópticas de las paredes del canal limitaron la utilidad del software de detección automática de células, lo que requirió un enfoque semiautomático. Las regiones con células se identificaron manualmente (Figura complementaria S7); Se generaron perfiles de líneas horizontales y verticales. El punto medio entre los picos y los valles en los perfiles de línea se utilizó para determinar los límites de las celdas (Figura complementaria S7). La distancia que viajó la celda hacia el canal cónico se midió como la distancia entre el centroide de la celda y la entrada del canal cónico.

El límite celular identificado a partir de la imagen de transmisión óptica se asignó a la misma ubicación en la imagen de fluorescencia. Las intensidades de píxeles de todos los píxeles en el límite celular se sumaron para calcular la fluorescencia celular. Todas las mediciones se corrigieron para la fluorescencia de fondo restando la intensidad de fluorescencia media de toda la imagen de fluorescencia multiplicada por el número de píxeles dentro del límite celular (Figura complementaria S8). La fluorescencia total se normalizó aún más de acuerdo con los parámetros de imagen experimentales. Como se resume en la Tabla complementaria S1, debido al nivel de expresión de la proteína intrínseca y el fondo de la muestra, los parámetros de imagen durante los experimentos variaron entre diferentes cepas y métodos de carga mecánica para no saturar la cámara EMCCD. Aquí, todas las mediciones de fluorescencia se normalizaron a los parámetros de imagen de ΔcrvA PmurJ:msfGFP en el dispositivo de microfluidos (tiempo de integración tnorm = 20 ms, EMnorm = 200 y Powernorm = 3,6 kW/cm2) para comparación. La fluorescencia total normalizada (FLnorm) se calculó utilizando la ecuación. (7):

Por ejemplo, la fluorescencia total corregida de fondo (FLvxrAB) calculada a partir de instantáneas de ΔcrvA PvxrAB:msfGFP en un dispositivo de microfluidos (tinte = 4 ms, EM = 100 y potencia = 3,6 kW/cm2) se normalizó para ser:

El límite celular se identificó utilizando un software MATLAB personalizado llamado iQPALM38 (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12642617.v1), y en la imagen fluorescente correspondiente, la fluorescencia total de la célula se cuantificó como la suma de la intensidad de todos los píxeles dentro de la máscara de celda como se ilustra en la Tabla complementaria S3. El fondo fluorescente promedio se calculó como el promedio de 20 píxeles aleatorios fuera de las celdas.

Luego se restó la fluorescencia promedio del fondo de cada píxel de la imagen para producir una imagen corregida. Luego se encontró la fluorescencia total de cada celda sumando la fluorescencia de cada píxel en la máscara celular de la imagen corregida. Este valor se normalizó aún más en función de los parámetros de imagen (Tabla complementaria S1) para que coincida con las imágenes de GFP en el dispositivo de microfluidos como se describe anteriormente.

Las células se cultivaron durante la noche (18 h) en LB (Sigma-Aldrich) con los antibióticos apropiados a 37 °C con agitación de 250 rpm. El cultivo nocturno se diluyó a 1:100 en medio mínimo M9 suplementado con 8% v/v de aminoácidos MEM 50X (GIBCO) y 4% de vitaminas 100X (GIBCO), que se denomina M9 suplementado en métodos posteriores. Las células se cultivaron durante 4 h a 37 °C hasta una DO600 ~ 0,4 para alcanzar la fase exponencial, luego se centrifugaron y se resuspendieron en medio mínimo M9 suplementado recientemente.

Para experimentos con inducción de isopropil ß-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG), se agregaron 100 µM de IPTG (Sigma-Aldrich) al cultivo celular después de la dilución de 4 h y se incubaron a 37 °C durante otra hora antes de cargar las células en el dispositivo de microfluidos y mantenido durante toda la duración del experimento.

Para los experimentos de compresión, el cultivo celular y la dilución durante la noche se prepararon como se describe en SI Sección. 0. Se centrifugaron dos mililitros de la dilución de 4 h y se resuspendieron en 30 µl de M9 suplementado. Las células se inmovilizaron para la aplicación de peso y la obtención de imágenes después de colocarlas entre un gel de agarosa al 3% (p/v) y un cubreobjetos. Para realizar la configuración de la muestra de compresión, se disolvió agarosa (Sigma-Aldrich) en el M9 suplementado calentándolo en un microondas, y se dejaron caer 50 µL de agarosa fundida sobre un portaobjetos de vidrio, seguido de la adición de otro portaobjetos de vidrio que luego se retiró después. el gel de agarosa solidificó a temperatura ambiente. Se colocaron dos microlitros de la muestra celular concentrada sobre la superficie del gel de agarosa y se cubrieron con un cubreobjetos. El M9 suplementado se añadió en el lateral para evitar que el sistema se seque, y se aplicaron pesas de acero inoxidable encima del cubreobjetos durante 2 h antes de obtener la imagen. Observamos que las celdas con una mayor fuerza aplicada experimentaron una mayor deformación, como lo demuestra un mayor ancho de celda (Figura complementaria S5).

Se aplicó presión hidrostática a un cultivo celular fluido a granel utilizando una bomba PneuWave (CorSolutions, Ithaca NY, EE. UU.). Se utilizó un tapón hecho a medida para evitar cualquier flujo. Se prepararon dos diluciones de células M9 suplementadas y se incubaron a 37 °C durante 4 h como se describe en los materiales complementarios. Mientras tanto, se añadió poli-l-lisina al 0,03% (Sigma-Aldrich) a la placa de Petri y se incubó a temperatura ambiente durante 4 h para funcionalizar el cubreobjetos. El exceso de solución de poli-l-lisina se lavó con agua estéril nanopura después de 4 h. A continuación, una de las diluciones de M9 suplementadas se mantuvo bajo presión hidrostática durante dos horas, mientras que la otra se mantuvo bajo presión atmosférica. Después de liberar la presión, se centrifugaron inmediatamente 2 ml de células, se resuspendieron en 200 µl de M9 suplementado y se colocaron 50 µl en uno de los compartimentos de una placa de Petri (CELLview, fondo de vidrio, cuatro compartimentos). Se utilizó el mismo procedimiento para una dilución celular de control en la que no se aplicó presión. Después de que la muestra de células se incubó en la placa de Petri durante 3 a 5 minutos, la placa se lavó con M9 suplementado pipeteando al menos 3 veces para eliminar las células flotantes sueltas antes de agregar 200 μL de M9 suplementado en cada compartimento.

Para monitorear el cambio del nivel de expresión de GFP celular bajo diversos estímulos mecánicos, utilizamos un microscopio de fluorescencia invertida (Olympus IX 71) para iluminar las células con un láser de 488 nm (Coherent INC, Sapphire 488-200 CW CDRH) en epi de campo amplio. modo. Se utilizó un filtro de paso de banda (Semrock, FF01-525/50) para la detección de fluorescencia verde de msfGFP. Debido a la diferencia en el nivel de expresión genética intrínseca, el tinte de duración del pulso de iluminación, la ganancia EM y la densidad de potencia local del láser variaron para las etiquetas GFP en el promotor VxrA y el promotor MurJ para no saturar la cámara EMCDD (Andor Technology, DU-897E -CSO-#BV) como se indica en la Tabla complementaria S1. Se utilizó un moldeador de haz superior plano pi shaper (Edmund óptica, n.° 12-644) para expandir el tamaño del haz láser en los experimentos de compresión para lograr un mayor rendimiento.

Las cepas bacterianas y los oligonucleótidos utilizados en este estudio se resumen en las tablas complementarias S2 y S3. Todas las cepas de V. cholerae utilizadas en este estudio fueron derivadas de la cepa N16961 de V. cholerae WT El Tor que se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados: estreptomicina (RPI, cat# S62000), 200 μg ml-1; ampicilina (RPI, cat# A40040), 100 μg ml-1; carbenicilina (RPI, cat# C46000), 50 μg ml-1; Kanamicina (RPI, cat# K22000), 20 μg ml-1. Para la inducción del promotor nativo o IPTG, 100 μg ml-1 de sal potásica de bencilpenicilina (PenG-Fisher BioReagents, n.° de cat. BP914-100) o 100 ~ 500 μM de isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG-GOLDBIO, n.° de cat. 12481C50) se complementan, respectivamente. A menos que se indique lo contrario, se inocularon medios líquidos LB a partir de un cultivo nocturno y se incubaron a 37 °C con agitación a 200 rpm hasta alcanzar la fase exponencial media (OD600 ~ 0,4).

Se utilizaron Escherichia coli DH5α λpir y SM10 λpir para todos los procedimientos de clonación mediante ensamblaje isotérmico {Gibson Assembly39} o transferencia conyugal de genes en cepas de Vibrio. Las cepas knockout se generaron mediante recombinación homóloga utilizando el vector suicida pCVD44240 y productos de PCR amplificados a partir de combinaciones de cebadores y bloques de genes en la Tabla complementaria S3. Para las cepas de fusión promotora y msfGFP, se clonaron ADN promotores amplificados de murJ o vxrAB en pJL1, un vector suicida para la integración cromosómica en el locus lacZ. Para las cepas de sobreexpresión de ShyA, ShyA se clonó en pHL100mob usando pares de cebadores para shyA (TD-JHS548/549) y la construcción final se introdujo en una variedad de cepas de Vibrio como una copia episomal del plásmido con un gen de resistencia a la kanamicina para el mantenimiento del plásmido. La construcción de la cepa vxrA::vxrAH301A se describe en la Ref.27; los reporteros se introdujeron en esta cepa como se describió anteriormente, usando pJL1.

Aunque los complementos de mutantes que incluyen PmurJ:msfGFP, PmurJΔvxrB box:msfGFP, vxrA H301A y PvxrAB:msfGFP también podrían ser útiles, los tres mutantes proporcionan suficiente perturbación genética para probar la relación entre el estrés mecánico y la señalización de vxrAB al tiempo que equilibran la fabricación intensiva en mano de obra. de sistemas de microfluidos para pruebas bajo carga de extrusión.

Se utilizaron modelos de regresión lineal de mínimos cuadrados ordinarios para determinar las tendencias en los datos. Al comparar las tendencias entre grupos separados, se utilizó regresión lineal multivariada con el método de Tukey para corregir comparaciones múltiples. Los análisis estadísticos se realizaron con un nivel de significancia de α = (0,05). Los datos se analizaron utilizando RStudio.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su material complementario.

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Reconocemos el apoyo a la investigación de NSF 2055214, 2135586 (CJH), NSF GRFP DGE-1650441 (CEH). Este trabajo se realizó en parte en Cornell NanoScale Facility, miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (Subvención NNCI-2025233). La investigación sobre VxrAB en el laboratorio de Dörr cuenta con el apoyo de la subvención R01AI143704 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH/NIAID). MRK cuenta con el respaldo de NSF GRFP #DGE-1650441.

Estos autores contribuyeron igualmente: Christine E. Harper y Wenyao Zhang.

Escuela Sibley de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Christine E. Harper, Junsung Lee, Ellen van Wijngaarden y Emily Chou

Escuela Meinig de Ingeniería Biomédica, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Christine Harper

Departamento de Química y Biología Química, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Wenyao Zhang, Zhaohong Wang y Peng Chen

Instituto Weill de Biología Celular y Molecular, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Jung-Ho Shin, Megan R. Keller y Tobias Dörr

Departamento de Microbiología, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Jung-Ho Shin y Tobias Dörr

Instituto Cornell de enfermedades e interacciones huésped-microbio, Universidad de Cornell, Ithaca, NY, 14853, EE. UU.

Tobias Dorr

Departamento de Bioingeniería y Ciencias Terapéuticas y Cirugía Ortopédica, Universidad de California, San Francisco, CA, 94143, EE. UU.

Cristóbal J. Hernández

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, EE. UU.

Cristóbal J. Hernández

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CEH: escribió el manuscrito, realizó experimentos de estímulos mecánicos (carga de extrusión, presión hidrostática y compresión) e imágenes, analizó y curó datos, realizó análisis estadísticos, fabricó dispositivos de microfluidos, escribió guiones para el procesamiento de imágenes, realizó procesamiento de imágenes; WZ: escribió el manuscrito, realizó experimentos de estímulos mecánicos (carga de extrusión, presión hidrostática y compresión) e imágenes, analizó datos, realizó procesamiento de imágenes; J.-HS y MRK: cepas construidas; EW: realizó experimentos de compresión, realizó procesamiento de imágenes; CE: procesamiento de imágenes realizado; JL realizó experimentos de presión hidrostática; ZW: contribuyó a la preparación de muestras y la obtención de imágenes; TD diseñó y dirigió la investigación, manuscrito editado; PC diseñó y dirigió la investigación, manuscrito editado; CJH diseñó y dirigió la investigación, manuscrito editado.

Correspondencia a Tobias Dörr, Peng Chen o Christopher J. Hernandez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Harper, CE, Zhang, W., Lee, J. et al. Los estímulos mecánicos activan la expresión genética a través de una vía de detección de estrés en la envoltura celular. Informe científico 13, 13979 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40897-w

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Recibido: 14 de junio de 2023

Aceptado: 17 de agosto de 2023

Publicado: 26 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40897-w

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